SECUAH 2021

dianas | Vol 9 No 1 | marzo 2020 | e202003

Generación de nuevos modelos animales mediante CRISPR/Cas9 para el estudio del cáncer de mama.

Raquel Sánchez-Baltasar, Angustias Page, Diana Menéndez-Pérez, Manuel Navarro, Ángel Ramírez

CIEMAT/imas12

raquelsb1992@gmail.com; raquel.sanchez@externos.ciemat.es

V Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2020.
16-18 de marzo, 2020. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

Palabras clave: Cáncer de mama; RASA1; CRISPR/Cas9; modelos animales

Resumen

El cáncer de mama es el tipo tumoral con mayor prevalencia y el segundo en mortalidad en la población femenina mundial. El tipo triple negativo, el más agresivo, con peor pronóstico y mortalidad a 5 años más elevada, se caracteriza por la ausencia de expresión de los marcadores tumorales. Es común encontrar una sobreactivación de la vía de Ras en estos tumores aunque las mutaciones en los genes de la familia de Ras no son frecuentes en el cáncer de mama. Estudios previos del grupo sugieren que esta activación de la vía de Ras puede deberse a la pérdida alélica del gen RASA1. RASA1 es un gen que genera una proteína de 120 KDa (p120RASGAP), cuya función principal es actuar como regulador negativo de RAS. En modelos animales, la deleción del dominio rasGAP en homocigosis produce una letalidad embrionaria a los 10,5 días. Por ello, nuestro grupo se propuso la generación de un modelo animal deficiente en RASA1 viable mediante el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 en estado embrionario, con el objetivo de estudiar el rol de RASA1 y la activación de la vía de Ras en el desarrollo del cáncer de mama. Para la generación del nuevo modelo, se diseñaron parejas de guías específicas para delecionar la secuencia del codón de inicio de transcripción del gen Rasa1 de forma precisa. El sistema CRISPR/Cas9 fue introducido como ribononucleoproteína mediante electroporación en embriones de una célula con el electroporador NEPA21, usando dos métodos: iGonad (improved Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) y ZEN (Zygote Electroporation of Nucleases). Aunque no se halló edición con el método iGonad, el método ZEN fue altamente eficaz, lográndose edición (tanto en heterocigosis como en homocigosis) en el 75% de los animales nacidos, que se tradujo en la generación de un cambio de fase en la secuencia del gen Rasa1 o en la pérdida del ATG canónico y obtención de una forma truncada en 5’, acompañado de reducción en los niveles de expresión. Aquellas líneas con deleción del ATG de inicio de transcripción dieron lugar a animales homocigotos viables, mientras que en las líneas en las que la edición se tradujo en un cambio en el marco de lectura solo se encontraron mutantes en homocigosis en estado embrionario. En conclusión, la utilización del sistema CRISPR/Cas9 en estado embrionario por electroporación mediante el método ZEN resultó eficaz, generando modelos animales deficientes en RASA1, verificando la letalidad de la falta de RASA1 en estado embrionario e indicando que la presencia de formas truncadas de la proteína es suficiente para la vida postnatal.