SECUAH 2018 > Blazquez etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803

Cuerpos Apoptóticos: nuevo sistema de comunicación intercelular

Rafael Blazquez, Coral García-Pastor, Javier Lucio-Cazaña,  Fernández-Martínez Ana-Belén

Universidad Autónoma de Madrid, Departamento de Biología

rafael.blazquez@estudiante.uam.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

SECUAH 2018 > López-Gutiérrez and Jiménez-Ruiz 2018

dianas | Vol 7 No 1 | 2018 | e201803a32

Introducción del sistema CRISPR/Cas9 en Leishmania infantum

Celia López Gutiérrez, Antonio Jiménez Ruiz

Departamento de Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

celialogu@hotmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3 – Biología y Tecnología Celular

Palabras clave: Leishmania infantum; CRISPR/Cas9; SMP-4; edición génica

Resumen

El sistema procariota CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated) ha sido adaptado para desarrollar una técnica de edición genómica con gran especifidad. Este sistema consiste en un RNA guía que conduce a la proteína Cas9 a una secuencia diana dentro del genoma para generar un corte de doble cadena, provocando la deleción de genes o la introducción de “tags”. En el género de parásitos Leishmania, la complejidad de su genoma ha dificultado la implantación de otras técnicas de ingeniería génica. Sin embargo, el sistema CRISPR/Cas9 ha demostrado ser eficiente en estos organismos. En 2017, Beneke y colaboradores desarrollaron una herramienta basada en CRISPR-Cas9 que permite el “tageo” y la deleción de genes en diversas especies de tripanosomátidos sin la necesidad de llevar acabo clonaje de DNA, lo cual simplifica y agiliza el desarrollo de la técnica. Esta método consiste en la transfección de un RNA guía y un casete de resistencia a antibiótico, ambos generados por PCR. Para la introducción de esta técnica en Leishmania infantum, se usó como diana una proteína conocida como proteína miristoilada pequeña 4 (SMP-4), la cual se ancla a la membrana celular del parásito por el grupo miristoilo. De esta forma, se produjo la deleción de una de las copias del gene y, por otro lado, se fusionó al gen que codifica para la proteína “NeonGreen”, la cual permite observar la localización de la proteína en el parásito gracias a la emisión de fluorescencia.

1. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A. and Charpentier, E. 2012. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. 337(6096):816-21.


2. Lachaud, L., Bourgeois, N., Kuk, N., Morelle, C., Crobu, L., Merlin, G., Bastien, P., Pagès, M. and Sterkers, Y. 2013. Constitutive mosaic aneuploidy is a unique genetic feature widespread in the Leishmania Microbes Infect.16(1):61-6.


3. Beneke, T., R., Makin, L., Valli, J., Sunter, J. and Gluenz, E. 2017. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. R Soc Open Sci.4(5):170095.


4. Tull, D., Naderer, T., Spurck, T., Mertens, H.D., Heng, J., McFadden, G.I., Gooley, P.R., McConville, M.J., 2010. Membrane protein SMP-1 is required for normal flagellum function in Leishmania. J. Cell Sci. 123, 544–554.

SECUAH 2018 > López-Llorente and Jorcano-Noval 2018

dianas | Vol 7 No 1 | 2018 | e201803a31

Detección y caracterización de interacciones físicas y moleculares en cultivos celulares 3D.

Verónica López Llorente, José Luis Jorcano Noval

Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT). Dirección Completa. Avenida Complutense, 40 (Madrid).España. Email: . Universidad Carlos III de Madrid, Avenida de la Universidad 30, Leganés (Madrid). España. Dpto.Biología de Sistemas, Universidad de Alcalá de Henares (Madrid), España.

veronica.lopez.llorente@gmail.com, veronica.lopez.llorente@gmail.com; veronica.lopez@ciemat.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A3 – Biología y Tecnología Celular

Palabras clave: morfogénesis epidérmica; microscopía confocal, cell tracking, cultivos 3D, AFM

Resumen

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS: Además de las señales bioquímicas, factores de crecimiento, hormonas, citoquinas y una compleja red de señalización celular que se encargan de regular procesos de proliferación, diferenciación y migración celular, así como de apoptosis, también se conoce que factores extrínsecos como fuerzas de tracción célula-célula y matriz- célula regulan el comportamiento celular. En tejidos biológicos vivos, estas fuerzas inter e intracelulares son esenciales para mantener la estructura y función del tejido y tienen una gran relevancia en el mantenimiento de la homeostasis (DuFort et al. 2011). La capacidad de las células para integrar esta información mecánica (mecanotransducción) también tiene un papel central en un amplio rango de procesos biológicos y se ha demostrado que tiene implicaciones importantes durante el desarrollo tisular y en el comienzo y progresión de muchas enfermedades (Orr et al. 2006, Ingber 2006). Sin embargo los mecanismos moleculares desencadenados por las respuestas bioquímicas de estas fuerzas mecánicas aún no se conocen bien, debido a la falta de métodos adecuados para medir estas fuerzas intercelulares con una alta resolución espacial y temporal. Por este motivo, el objetivo principal de mi trabajo es desarrollar una nueva metodología experimental para medir la evolución espacio-temporal de las fuerzas intercelulares en tejidos tridimensionales, en concreto durante la morfogénesis epidérmica, mediante experimentos de cell tracking y medición de fuerzas celulares. MÉTODOS: Estos estudios se realizan sobre cultivos organotípicos tridimensionales generados in vitro a partir de queratinocitos y fibroblastos obtenidos de biopsias humanas mediante digestión enzimática y plasma humano procedente de voluntarios sanos. Para los experimentos de cell tracking, dos poblaciones de queratinocitos se transducen para que expresen H2B-GFP y H2B-mCherry respectivamente, de manera que somos capaces de crear una piel in vitro en la que un porcentaje elevado de queratinocitos expresan GFP en su núcleo y alrededor de un 3% de queratinocitos expresan mCherry, lo que facilita la tarea de reconocimiento de los grupos celulares de la membrana basal que van a ser visualizados mediante microscopía confocal a diferentes tiempos durante el proceso formación del epitelio. Para los experimentos de medición de fuerzas, se utiliza un microrod (varilla) de fibra de carbono que es posicionado en la muestra en el momento del inicio de la diferenciación epidérmica. Así, cuando las células comienzan a formar las distintas capas de la epidermis, esta varilla se deforma. Conociendo las propiedades físicas de la fibra de carbono, somos capaces de calcular las fuerzas que están ejerciendo las células a partir de la deformación que han originado las mismas sobre la varilla mediante el análisis de las imágenes obtenidas por microscopía confocal. Además, también se ha incluido en los experimentos, la validación de los resultados obtenidos de la medición de fuerzas a través del método propuesto, mediante la utilización de microscopía de fuerza atómica. El reto que plantean estos estudios es principalmente la inestabilidad de la matriz tridimensional de fibrina que actúa como dermis sustentando el sistema sobre el que se realizan las medidas, ya que se trata de una estructura dinámica que sufre remodelaciones y cambios en su composición a lo largo de los 21 días necesarios para la diferenciación completa de la piel. Por este motivo, como parte de los objetivos del proyecto, se está trabajando en la mejora y optimización de la matriz 3D, mediante la inclusión de nuevos biomateriales naturalmente presentes en la piel.