SECUAH 2018 > Sanmartín-Salinas etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | 2018 | e201803

El Substrato del receptor de Insulina-4 está sobreexpresado en el cáncer colorrectal y promueve la activación del ciclo celular a través de la vía Rb/E2F

Patricia Sanmartín Salinas, M. Val Toledo Lobo, Fernando Noguerales Fraguas, Miguel Toro Londoño, Antonio Jiménez Ruiz, Luis G. Guijarro

Universidad de Alcalá

patry.sanmartin@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión A1 – Cáncer
Premio a la mejor comunicación.

Resumen

INTRODUCCIÓN: El cáncer colorrectal (CCR) es la segunda causa de muerte relacionada con el cáncer y es el tumor maligno de mayor incidencia si tenemos en cuenta ambos sexos, en España [1]. El substrato del receptor de insulina 4 (IRS-4) es una proteína adaptadora muy poco estudiada y la hipótesis que relaciona su función con el desarrollo tumoral cada vez gana más fuerza [2]. MÉTODOS: Los estudios se llevaron a cabo in vitro (línea celular de cáncer de colon RKO) e in vivo, utilizando biopsias humanas de cáncer colorrectal (n=20) y tejido normal adyacente (n=20). Para analizar la expresión y localización del IRS-4 se usaron técnicas de inmunohistoquímica e inmunocitoquímica. Para estudiar el efecto de la sobreexpresión del IRS-4 y su papel en el ciclo celular, se llevó a cabo la construcción de un plásmido que incorporaba la secuencia codificante de dicha proteína. Se analizaron los efectos de la sobreexpresión del IRS-4 con y sin wortmanina y los resultados se evaluaron mediante inmunoprecipitación, fraccionamiento subcelular, western blot y qPCR. RESULTADOS: El tratamiento con dosis fisiológicas de IGF-1 produjo una translocación subcelular de IRS-4 desde el citoplasma hacia el núcleo en células RKO. La sobreexpresión de IRS-4 en dichas células dio lugar a un aumento de la proteína fosforilada del retinoblastoma (pRb Ser 809/811 y pRB Ser 705), así como de la expresión de E2F, ciclina E y ciclina D1, comparado con las células control. Algunos de estos cambios fueron parcialmente revertidos al tratar las células con wortmanina. En cuanto a los estudios realizados en las muestras de pacientes con CCR se observó mediante fraccionamiento subcelular una clara sobreexpresión de IRS-4 en el citoplasma, membrana y núcleo, mientras que los niveles de proteína fueron prácticamente indetectables en los tres compartimentos del tejido normal. Estudios inmunohistoquímicos mostraron una tinción nuclear positiva de IRS-4 en el 74% de las células tumorales, respecto a un 22% de células normales. La sobreexpresión de IRS-4 en las muestras de pacientes con CCR se correlacionó positivamente y de forma significativa con el incremento de varias proteínas importantes del ciclo celular para el control en el punto de restricción G1/S, como ciclina D1 (r = 0.6662), Rb (r = 0.7779), pRb serina 809/811 (r = 0.6864), pRb serina 705 (r = 0.6261) y E2F1 (r = 0.8702). CONCLUSIÓN: Nuestros resultados sugieren que el IRS-4 promueve la activación del ciclo celular a través de la activación de la vía Rb/E2F y podría servir como una diana farmacológica dada su sobreexpresión en el tejido tumoral y sus niveles apenas detectables en el tejido normal adyacente.1. Galceran J, Ameijide A, Carulla M, Mateos A, Quiros JR, Rojas D, et al. Cancer incidence in Spain, 2015. Clinical & translational oncology. 2017;19(7):799-825. 2. Sanmartin-Salinas P, Lobo M, Noguerales-Fraguas F, Londono MT, Jimenez-Ruiz A, Guijarro LG. Insulin receptor substrate-4 is overexpressed in colorectal cancer and promotes retinoblastoma-cyclin-dependent kinase activation. Journal of gastroenterology. 2018.

SECUAH 2018 > Pérez-Chávez and Fernández-Martínez 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803a24

RAR-β, la nueva diana terapéutica para potenciar los efectos antitumorales del Cisplatino en cáncer de próstata.

Israel Pérez Chávez^a, Ana Belén Fernández Martínez^b

Facultad de Biología. Universidad Autónoma de Madrid. Darwin, 2. 28049 Canto Blanco, Madrid.

a. isradumbo@gmail.com; israel.perezc@estudiante.uam.es  b. anab.fernandez@uam.es 

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión de paneles

Palabras clave: cisplatino; RAR-β; PC-3; próstata; Le135; cáncer

Resumen

El cáncer de próstata se muestra como el cáncer de mayor incidencia en varones, además del segundo puesto en mortalidad. Encontrar nuevas formas de tratamiento es fundamental ya que durante las fases iniciales de la enfermedad nos encontramos con un tumor localizado, que puede ser extraído mediante prostatectomía y ablación de andrógenos reduciendo el tumor con gran efectividad. Sin embargo, a medida que avanza el tumor, este se extiende, y vuelve independiente de andrógenos. Esta fase cuenta con una alta peligrosidad debido a la inexistencia de tratamientos efectivos para la eliminación del cáncer. Por ello la línea celular estudiada en el presente trabajo es la línea PC-3, células independientes de andrógenos. Una posible aproximación es el uso del fármaco cisplatino un compuesto quimioterapéutico que provoca Cross-links de DNA y aductos impidiendo la transcripción y replicación del DNA, causando la muerte celular. El problema principal es que este fármaco causa nefrotoxicidad y neurotoxicidad entre otros efectos y que además, pierde efectividad en tratamientos sucesivos. Por ello, se propone el co-tratamiento con un antagonista de RAR-β, es decir, el receptor del ácido retinoico β. El ácido retinoico, cuenta entre sus funciones la de crecimiento y diferenciación celular, es regulado por distintos receptores nucleares como RAR y, junto con sus derivados, es utilizado como antineoplásico. Sin embargo; ¿Por qué usar un antagonista de uno de sus receptores, teniendo en cuenta su potencial como anticancerígeno? De las 5 isoformas descritas de RAR-β, a 4 se les asocia un papel oncogenético debido a su expresión aberrante en distintos tipos de cáncer. Por lo tanto, el uso de antagonistas de RAR-β podría ser un tratamiento efectivo que permitiría disminuir la dosis de cisplatino, y eliminar sus perjuicios. Para ello usamos un antagonista de RAR-β (Le135) además de un panantagonista de RAR (Le540) con el objetivo de estudiar la influencia de Le135 y cisplatino sobre la viabilidad celular, además del tratamiento conjunto. Para estudiar la viabilidad, se realizaron ensayos MTT, tinción con cristal violeta y tinción con DAPI. Se observó una disminución significativa de la viabilidad celular en el cotratamiento de Le135 con cisplatino, en comparación al cisplatino de manera individual, además no se observaron diferencias apreciables en la viabilidad con el tratamiento con Le540. La disposición de los microfilamentos de actina se analizó mediante una inmunofluorescencia de faloidina, observándose pérdida de simetría tras los tratamientos. Se estudió la capacidad proliferativa mediante una inmunofluorescencia con BrdU, observándose una disminución del número de células con cisplatino y una disminución del número de células y de células proliferativas con cisplatino + Le135. Por último, se analizó el posible mecanismo de inducción de muerte celular a través de una inmunofluorescencia anti-caspasa 3. No se observó marcaje de caspasa-3 en los tratamientos por lo que la muerte celular no se produce a través de esta vía.

SECUAH 2018 > Orea-Martínez etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803a21

Silenciamiento epigenético de CLDN3 en células de cáncer de próstata resistentes a los tratamientos hormonales

María Jesús Orea Martínez^1,a, Ana González-Corpas¹, Begoña Colás¹, Javier Angulo², Santiago Ropero¹

1. Departamento de Biología de Sistemas. Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.  2. Departamento de Urología, Hospital Universitario de Getafe, Madrid, España. 

a. oreamariajesus@gmail.com 

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

Palabras clave: Cáncer de próstata; receptor de andrógenos; modificaciones epigenéticas; CLDN3; bloqueo hormonal

Resumen

El cáncer de próstata es la segunda causa de muerte entre los hombres en los países desarrollados. La mayoría de los tumores de próstata son dependientes de andrógenos en el momento del diagnóstico, de ahí que uno de los tratamientos clásicos sea el bloqueo hormonal mediante la ablación androgénica. Aunque prolonga la supervivencia, la respuesta a estos tratamientos es limitada y de forma casi invariable los pacientes desarrollan resistencia al bloqueo hormonal continuado. Los cambios en las modificaciones epigenéticas juegan un papel decisivo en el desarrollo y progresión del cáncer, así como en el desarrollo de la resistencia de los tumores a los tratamientos convencionales. En este trabajo nos propusimos analizar el papel de la metilación del DNA en el desarrollo de resistencia de los tumores de próstata al bloqueo hormonal. La comparación de los datos obtenidos del array de metilación y del array de expresión nos proporcionó una lista de genes desregulados en LNCaP abl por cambios en el estado de metilación de su promotor: EGF, ELF5 y HYI se encuentran sobreexpresados por hipometilación de su región promotora y CLDN3, MARCKS y THBS1 presentan una disminución en su expresión por hipermetilación en su promotor. Nosotros hemos seleccionado CLDN3 para nuestro estudio porque codifica para una proteína implicada en las uniones estrechas entre células. La pérdida de expresión de CLDN3 en LNCaP abl está asociada con marcas de inhibición transcripcional en su región promotora (me3K27H3). En LNCaP encontramos marcas de activación transcripcional en la región promotora de CLDN3 (AcH3 y me3K4H3). Finalmente, hemos querido analizar la relevancia funcional en los cambios de expresión de CLDN3 en nuestro sistema celular, para ello realizamos ensayos de invasión en ambas líneas celulares, observando un incremento en el proceso de invasión en LNCaP abl. Para verificar este fenotipo decidimos inhibir la expresión de CLDN3 en LNCaP y repetir los experimentos, comprobando que la pérdida de expresión de CLDN3 incrementa la invasión, recuperando el fenotipo invasivo de LNCaP abl. Hemos identificado un grupo de genes cuya expresión está regulada por cambios en el estado de metilación de su región promotora en líneas celulares de cáncer de próstata que no responden a andrógenos y, cuyos cambios de expresión podrían tener un papel relevante en el desarrollo de tumores de próstata resistentes a los tratamientos hormonales. En particular el silenciamiento epigenético de CLDN3 puede tener un papel relevante en el desarrollo de CRPC.

SECUAH 2018 > Madrigal-Martínez etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | 2018 | e201803

Prostaglandina E-2 intracelular activa los fenotipos tumorales en cáncer de próstata a través de la ciclooxigenasa-2

Antonio Madrigal Martínez, Ana Belen Fernández Martínez, Francisco Javier de Lucio Cazaña

antoniomadrigalmartinez@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

Resumen

Ciclooxigenasa-2 (COX-2) es uno de los mediadores de la inflamación que juega un papel importante en la progresión del cáncer de próstata (CP), produce diferentes prostanoides, como la prostaglandina E2. Además, el factor inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) juega un papel muy importante en CP, al inducir numerosos genes que contribuyen a la progresión del CP. Estudios previos de nuestro grupo de investigación, han demostrado que PGE2 intracelular (iPGE2) es capaz de activar diferentes fenotipos tumorales en células de CP y que existe una retroalimentación positiva COX-2-PGE2 que amplifica la señal inflamatoria iniciada por COX-2, ya que iPGE2 aumenta la expresión de COX-2 en células de CP. Nuestro objetivo es estudiar si iPGE2 activa los fenotipos de manera dependiente de COX-2 en una línea celular representativa de un estadio andrógeno-independiente de cáncer de próstata (PC3). Nuestros resultados muestran que iPGE2 disminuye la adhesión celular y aumenta la proliferación, migración e invasión celular, y aumenta la expresión de HIF-1α de forma dependiente de COX-2. Estos resultados sugieren que el aumento de expresión de COX-2 es fundamental para que iPGE2 active los diferentes fenotipos tumorales, contribuyendo a la progresión de CP.

SECUAH 2018 > Segovia etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | 2018 | e201803

Inhibition of a G9a-Ezh2 network triggers an immune-mediated bladder cancer regression.

Cristina Segovia, Edurne San José-Enériz, Monica Martínez-Fernández, Ester Munera-Maravilla, Leire Garate, Estíbaliz Miranda, Iris Lodewijk, Carolina Rubio, Carmen Segrelles, Obdulia Rabal, Noelia Casares, Alejandra Bernardini, José A Casado, Marta Dueñas, Felipe Villacampa, Juan José Lasarte, Felix Guerrero, Guillermo de Velasco, Julen Oyarzabal, Daniel Castellano, Xabier Aguirre, Felipe Prósper, Jesús M. Paramio

CIEMAT

crismaitia@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

Abstract

Bladder cancer (BC) represents the 7th most common cancer in men and the 17th in women. At diagnoses, approximately 75% of patients present with a non-muscle invasive disease (NMIBC) and the remaining 25% of the patients showed muscle-invasive cancer (MIBC). This pathology classification determines the treatment. NMIBC are treated by transurethral resection, which can be followed by intravesical instillation with BCG or mytomycin. However, a large proportion of NMIBC show a high rate of recurrence and, in some cases, these recurrences display increased aggressiveness progressing to MIBC. The current therapeutic options of MIBC include radical cystectomy, and cisplatin-based chemotherapy with poor clinical results. In a high proportion of the cases, the disease progress showing metastatic spreading, accounting for an extremely low survival. Moreover, an important fraction of the MIBC patients presents severe comorbidities due to other pathological conditions being considered ineligible for chemotherapy with few or no therapeutic alternatives. Recently, immune checkpoint inhibitors, based on PD-1 or PDL1 blockade, have demonstrated promising results in advanced BC patients. However, the number of patients that may benefit from these therapies is still limited, as a relevant fraction does not show objective responses accounting for only partial overall survival increase. Consequently, there is a need of new avenues in advanced BC management. The molecular landscape of BC has identified multiple alterations in genes governing chromatin organization and histone modifications. The epigenomic profiles correlate with the clinical outcome indicating possible therapeutic options for patients. Regarding the chromatin-remodeler genes, the involvement of EZH2 has gained relevance in the last years, due to its implication in multiple malignancies, especially in BC. EZH2 is a histone methyltransferase that regulates gene silencing through H3K27me3 marks. G9a is another histone-methyltransferase generating H3K9me2. In addition G9a can also monomethylate H3K27 thus priming for EZH2 activity. Moreover G9a and EZH2 interact in vivo and in vitro to modulate specific gene silencing through specific genomic recruitment to a subset of target genes. However the possible roles of G9A in BC have not been elucidated. Here we report that increased expression of G9a is characteristic of BC cases in association with poor clinical outcome of bladder cancer patient. This opens the possibility that G9a inhibitors can be of benefit in the management of BC. We show that a recently described G9a/DNMT dual inhibitor (CM272) is active in BC cells in vitro and in vivo. Moreover, we also demonstrate a synergistic effect of this inhibitor with cisplatin, the current chemotherapeutic for advanced bladder cancer, in vitro and in vivo. Remarkably, in a transgenic mouse model of metastatic bladder cancer, based on the simultaneous deletion of various tumor suppressor genes in urothelial cells, the combined treatment resulted in almost complete tumor and metastasis eradication mainly through activation of immune system. These findings, support new and promising opportunities for the therapy of bladder cancer.

SECUAH 2018 > Peña-Asensio etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803

Bloqueo del miR-23a como estrategia restauradora de la respuesta celular T CD8+ específica contra antígenos asociados a hepatocarcinoma

Julia Peña Asensio, Elia Moreno-Cubero, Juan Ramón Larrubia Marfil

Hospital Universitario de Guadalajara

julia.pena@edu.uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

Resumen

La presencia de células T CD8 específicas con actividad efectora adecuada es esencial para el reconocimiento y eliminación de células tumorales. Sin embargo, el tumor genera un microambiente local de citoquinas supresoras, encaminado a neutralizar la actividad anti-tumoral de la respuesta inmune adaptativa. El factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1) secretado por las células tumorales provoca cambios epigenéticos que inducen la inmunosupresión de las células T CD8 específicas contra antígenos asociados a hepatocarcinoma. TGF-β1 produce un aumento del miR-23a que, a su vez, bloquea la expresión del factor de transcripción BLIMP-1, lo que se traduce en una incorrecta diferenciación hacia célula efectora, caracterizada por disminución de granzima B e interferón (IFN)-γ, llevando a las células a un estado de agotamiento (fenotipo CD127-, PD-1+). El bloqueo in vitro de la acción de este miR-23a con el anti-miR apropiado permitirá la restauración de la actividad efectora tras el encuentro antigénico. Esta metodología podrá ser utilizada como estrategia para la transferencia de T CD8 específicos contra antígenos asociados a hepatocarcinoma (AAH-específicos) con capacidad efectora restaurada, lo que indudablemente podría impactar en la supervivencia de pacientes con hepatocarcinoma.

SECUAH 2018 > Arranz-Nicolás etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803

DGKα inactivation is an integral component of the costimulatory pathway that amplifies TCR signals

Javier Arranz-Nicolás, Antonia Ávila-Flores,  Isabel Mérida

Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC)

jarranz@cnb.csic.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2018.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

Abstract

The arsenal of cancer therapies has evolved to target T lymphocytes and restore their capacity to destroy tumor cells. T cells rely on diacylglycerol (DAG) to carry out their functions. DAG availability and signaling are regulated by the enzymes diacylglycerol kinase (DGK) and , whose excess function drives T cells into hyporesponsive states. Targeting DGK is a promising strategy for coping with cancer; its blockade could reinstate T cell attack on tumors while limiting tumor growth, due to positive DGK functions in several oncogenic pathways. Here we made a side-by-side comparison of the effects of commercial pharmacological DGK inhibitors on T cell responses with those promoted by DGK and DGK genetic deletion or silencing. We show the specificity for DGK of DGK inhibitors I and II and the structurally similar compound ritanserin. Inhibitor treatment promoted Ras/ERK (extracellular signal-regulated kinase) signaling and AP-1 (Activator protein-1) transcription, facilitated DGK membrane localization, reduced the requirement for costimulation, and cooperated with enhanced activation following DGK silencing/deletion. DGKiII and ritanserin had similar effects on TCR proximal signaling, but ritanserin counteracted long-term T cell activation, an effect that was potentiated in DGK-/- cells. In contrast with enhanced activation triggered by pharmacological inhibition, DGK silencing/genetic deletion led to impaired Lck (lymphocyte-specific protein tyrosine kinase) activation and limited costimulation responses. Our results demonstrate that pharmacological inhibition of DGK downstream of the TCR provides a gain-of-function effect that amplifies the DAG-dependent signaling cascade, an ability that could be exploited therapeutically to reinvigorate T cells to attack tumors.