SECUAH 2018 > Moreno-Gómez-Toledano etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803

Efecto del Bisfenol-A (BFA) en podocitos humanos: primeras aproximaciones.

Rafael Moreno-Gómez-Toledano, Clara González-Martínez, Ricardo J. Bosch

Universidad de Alcalá

r.morenogomeztoledano@gmail.com

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

SECUAH 2018 > Bernal and Roza 2018

dianas | Vol 7 No 1 | marzo 2018 | e201803b12

Inmunohistoquímica en ganglios de la raíz dorsal transparentes tras marcaje retrógrado de neuromas experimentales en ratón

Laura Bernal, Carolina Roza

Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.

laura.bernal@uah.es

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión

Palabras clave: ganglio de la raíz dorsal; nervio periférico; marcaje retrógrado; inmunohistoquímica; inCLARITY

Resumen

La caracterización molecular de neuronas axotomizadas se realiza generalmente con inmunohistoquímica en secciones congeladas de ganglio de la raíz dorsal y nervio perifério. Esta técnica es tediosa, larga y lleva a la pérdida de información. El uso de microscopía confocal en tejido no-seccionado no es posible debido a la dispersión de la luz, un problema que fue solucionado con el desarrollo de la técnica CLARITY [1]. Desde entonces se han desarrollado numerosos protocolos que tarnsforman tejido intacto en una estructura ópticamente transparente, que en combinación con inmunohistoquímica y marcaje retrógrado, permiten la reconstrucción 3D de tractos neuronales. Nos propusimos adaptar el primer protocolo descrito por uno simplificado, pasivo y de precio reducido (inCLARITY) para estudiar el sistema nervioso periférico. Evaluamos su compatibilidad con diferentes marcadores retrógrados (DiI, Fluoro-gold -FG-, Fluoro-ruby -FR-, Fluoro-emerald -FE- and Retrobeads -RB-) así como con inmunohistoquímica específica contra nociceptores. En ratones adultos se realizó una cirugía en la cual se seccionan dos de las tres ramas periféricas del nervio ciático, que fueron luego introducidas en un tubo para evitar la reinervación. En el extremo cortado se marcó con los diferentes marcadores retrógrados. La incisión se cerró. Dos semanas después los animales fueron perfundidos y el tejido extraido y procesado para cryo-sección (crioprotegido en sacarosa 30% y congelado en OCT) o para transparentación (embebido en una mezcla de acrilamida/bisacrilamida/V-50 durante 4h a 37ºC y después en SDS 8%). En el tejido transparente se realizó inmunohistoquímica en free-floating frente a marcadores de nociceptores (IB4 y CGRP) y fibras periféricas (IB4, PanNav). Nuestros resultados muestran como el protocolo implementado (inCLARITY) funciona perfectamente en ganglios de la raíz dorsal y nervios periféricos en 7-12 días, sin producir cambios en volumen o estructura. Además, todos los marcadores retrógrados fueron compatibles con esta técnica. Al igual que en las crio-secciones, FG marcó muchas células, la mayoría de ellas con citoplasma vacuolado. La tinción de DiI fue pobre para ambos protocolos. FR y FE en crio-secciones solo se visualizaron después de inmunotinción contra el fluoróforo, pero ambas se observaron directamente con inCLARITY. RB se observaron bien y con un fondo muy bajo mediante el uso de ambas técnicas. Además, IB4 y CGRP se observaron claramente en ganglios transparentes. En nervios transparentes, la tinción con IB4 mostró claramente diferencias entre fibras intactas y dañadas y los nodos de Ranvier se identificaron fácilmente con el marcador PanNav. Como conclusión, podemos afirmar que hemos desarrollado con éxito un nuevo protocolo asequible para todos los laboratorios y que hace transparente tejido nervioso periférico. Además, este método presenta varias ventajas en comparación con el procesamiento tradicional. Hemos demostramos su compatibilidad con cinco trazadores retrógrados diferentes utilizados comúnmente en el área de la neurobiología. Además, mostramos cómo es posible realizar inmunotinción para fenotipar diferentes poblaciones neuronales. Con respecto a los nervios periféricos, la inmunohistoquímica en nervios transparentes permite estudiar los cambios morfológicos y moleculares después de la axotomía sin alterar su estructura.

1. Chung K, Wallace J, Kim SY, Kalyanasundaram S, Andalman AS, Davidson TJ, Mirzabekov JJ, Zalocusky KA, Mattis J, Denisin AK, Pak S, Bernstein H, Ramakrishnan C, Grosenick L, Gradinaru V, Deisseroth K. 2013. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. May 16;497(7449):332-7. doi: 10.1038/nature12107.

SECUAH 2018 > Amaro-Villalobos etal 2018

dianas | Vol 7 No 1 | 2018 | e201803b33

El fracaso renal agudo asociado a rabdiomiolisis regula la expresión de Klotho

Juan Manuel Amaro Villalobos^1,a, Melania Guerrero-Hue¹, Cristina García Caballero ¹, Carmen Herencia¹, Cristina Vázquez Carballo¹, Alfonso Rubio Navarro¹, Jesús Egido², Juan Antonio Moreno^1,b

1. Renal, Vascular and Diabetes Research Laboratory, Fundación Instituto de Investigación Sanitaria-Fundación Jiménez Díaz, Autónoma University, Madrid, Spain.  2. Spanish Biomedical Research Centre in Diabetes and Associated Metabolic Disorders (CIBERDEM), Madrid, Spain. 

a. juanmanuel2191@gmail.com  b. jamoreno@fjd.es 

III Congreso de Señalización Celular, SECUAH 2017.
20-22 de marzo, 2018. Universidad de Alcalá. Alcalá de Henares, Madrid. España.
Sesión B3 – Fisiología

Resumen

La mioglobina es la hemoproteína responsable del transporte y almacenamiento del oxígeno dentro del tejido muscular. Cuando el músculo sufre un daño severo (rabdomiólisis), esta proteína se libera al torrente sanguíneo y se acumula en el riñón, donde resulta nefrotóxica y causa fracaso renal agudo (FRA). Klotho es una proteína anti-envejecimiento que se produce en el riñón y cuya expresión disminuye en situaciones de daño renal. En este trabajo analizamos la expresión de Klotho en el FRA asociado a rabdomiolisis. Realizamos un modelo experimental de fracaso renal agudo asociado a rabdomiolisis a partir de la inyección intramuscular de glicerol al 50% (10mg/kg de peso) en ratones machos C57BL/6 de 12 semanas de edad. Los animales fueron sacrificados al día 1, 3 y 7 post-inyección de glicerol. Se recogieron muestras de sangre y riñón para realizar estudios de expresión génica por Real Time-PCR y expresión proteica por western blot e inmunohistoquímica. Además, realizamos estudios en células tubulares murinas (MCTs) para analizar los mecanismos moleculares implicados en la regulación de la expresión de Klotho por la mioglobina. Los ratones con rabdomiolisis presentaron un incremento de los niveles séricos de creatinina, así como daño histológico. En línea con estos resultados, observamos un aumento en la expresión génica de marcadores de daño tubular (NGAL y KIM-1), producción de citoquinas proinflamatorias (CCL2 y CCL5), estrés oxidativo (4-HNE) y muerte celular (TUNEL). La rabdomiólisis redujo la expresión renal de Klotho tanto a nivel génico como proteico, alcanzando un descenso máximo a los 3 días tras la inducción del daño. En células tubulares, la administración de mioglobina indujo estrés oxidativo y expresión de citoquinas inflamatorias, así como un descenso en la expresión génica y proteica de Klotho. Por último, observamos que la pre- estimulación con diversos agentes antioxidantes como (NAC) o sulforafano (inductor de Nrf2), revertía la disminución de Klotho inducida por mioglobina. En conclusión, el fracaso renal agudo asociado a rabdomiolisis disminuye la expresión renal de Klotho por un mecanismo relacionado a la presencia de estrés oxidativo en esta patología.