La cascada de transducción de señales de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs) juega un papel fundamental en el control de la proliferación, diferenciación, adhesión, migración y apoptosis celular. Uno de sus miembros, BRAF, se encuentra mutado en la forma ^V600EBRAF en un 44% de los Carcinomas Papilares Tiroideos y en un 24% de los Carcinomas Anaplásicos Tiroideos y es responsable de los casos de cáncer más agresivos en este órgano endocrino. Por otra parte, en etapas de tumorogénesis avanzada, la citoquina TGFβ desempeña un papel importante en el incremento de la invasión y la migración celular, mediante la inducción de la transición epitelio-mesénquima. Este proceso implica, principalmente, el aumento de los niveles de los factores de transcripción Snail y Slug, los cuales inhiben la síntesis de la glicoproteína de unión celular, E-Cadherina. Además, en los procesos de migración e invasión se produce una restructuración del citoesqueleto celular donde las proteínas Src y FAK son fundamentales. Por todo ello, en este proyecto se pretende estudiar la relación entre los efectos metastásicos de ^V600EBRAF y TGFβ, así como el papel de las proteínas implicadas en el proceso invasivo Snail, Slug, E-Cadherina, Src, FAK y GSK3β. Para ello, hemos utilizado la línea celular BHT101, derivada de un tumor anaplásico tiroideo y que posee la mutación ^V600EBRAF. Mediante el uso de inhibidores específicos de las diferentes proteínas estudiadas o silenciando su expresión mediante la técnica de RNA de interferencia, hemos obtenido resultados que demuestran que en esta línea celular, ^V600EBRAF y TGFβ favorecen la carcinogénesis tanto por rutas conjuntas, como mediante mecanismos independientes.

El cáncer de tiroides es el tumor endocrino más común y, aunque es altamente curativo, presenta una elevada tasa de recurrencia [1]. Una de las mutaciones más frecuentes en este tipo de tumores es la sustitución de la Valina 600 por un Glutámico (V600E) en la proteína BRAF. Esta mutación causa una hiperactivación de la vía de las ERK-MAPKs, favoreciendo la proliferación e invasividad tumoral e inhibiendo la muerte celular por apoptosis [2,3]. Sin embargo, las terapias con inhibidores de BRAF no dan los resultados esperados en el tratamiento del cáncer de tiroides, ya que causa importantes efectos adversos de lesiones de la piel asociadas a hiperproliferación llegando, en algunos casos, a producirse carcinomas de células escamosas y queratoacantomas en un 15-30% de los pacientes [4]. Debido a esto, se plantea la necesidad de utilizar terapias combinadas para aumentar la efectividad y especificidad del tratamiento en este tipo de cáncer. Por otra parte, la autofagia es un proceso celular por el cual se produce un reciclaje de los componentes celulares, mediante su incorporación a lisosomas a través de la formación de unas vesículas denominadas autofagosomas [5]. Este proceso ha adquirido gran importancia en el estudio del cáncer y se le han atribuido tanto efectos pro-tumorales, ya que actúa como método de defensa frente a situaciones de estrés celular, como anti-tumorales llevando a la muerte celular [6,7]. Por todo ello, estudiamos el papel que posee la autofagia en células tumorales tiroideas que presentan la mutación ^V600EBRAF sobre la viabilidad celular y la sensibilidad al tratamiento con PLX4720, el inhibidor de ^V600EBRAF. Para ello, en primer lugar analizamos como la inhibición de BRAF, por el tratamiento inhibitorio con PLX4720 o silenciamiento con siRNA, modula la autofagia en la línea celular derivada de un tumor anaplásico tiroideo BHT101. La eliminación de la actividad y expresión de BRAF disminuye los niveles de la proteína p62 y aumenta los de la proteína LC3-II, indicativos de activación del proceso de autofagia. Esta modulación parece llevarla a cabo a través de la regulación de AMPK y mTOR, principales reguladores del proceso autofágico [8]. Respecto a la viabilidad celular y la apoptosis, la determinamos mediante MTT y citometría de flujo, tras el tratamiento con los inhibidores de la autofagia Bafilomicina A1 o 3-metiladenina (3-MA), en las células BHT101. Nuestros resultados indican que la inhibición de la autofagia aumenta la muerte celular en estas células. Por otra parte, el tratamiento con PLX4720 junto con la inhibición de la autofagia produce mayores efectos sobre la supervivencia que cada tratamiento por separado.Todos estos datos indican que la autofagia es un proceso modulador de la supervivencia de las células tumorales tiroideas y podría ser utilizada como una diana terapéutica en los tumores tiroideos con la mutación ^V600EBRAF que no responden adecuadamente al tratamiento convencional con PLX4720.

1. Migzhao, Xing. 2013. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews/Cancer, 13:184-99.
2. Kam-Tsun, Tang y Chen Hsen, Lee. 2010. BRAF mutation in papillary thyroid carcinoma: pathogenic role and clinical implicaions. J Chin Med Assoc., 73 (3):113-128.
3. Karasarides M, Chiloeches A, Hayward R, Niculescu-Duvaz D, Scanlon I, Friedlos F, y cols. 2004. B‐RAF is a therapeutic target in melanoma. Oncogene, 23(37): 6292‐
4. Flaherty, K., Puzanov, I., Sosman, J., Kim, K., Ribas, A., McArthur, G., et al. 2009. Phase I study of PLX4032: Proof of concept for V600EBRAF mutation as a therapeutic target. J Clin Oncol., 27.
5. Boya P, Reggiori F, Codogno P. Emerging regulation and functions of autophagy. Nat Cell Biol. 15: 713-20.
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7. Vucicevic L, Misirkic M, Janjetovic K, Vilimanovich U, Sudar E, Isenovic E, Prica M, Harhaji-Trajkovic L, Kravic-Stevovic T, Bumbasirevic V y Trajkovic V. 2011. Compound C induces protective autophagy in cancer cells through AMPK inhibition-independent blockade of Akt/mTOR pathway. Autophagy, 7(1): 40-50.
8. Eskelinen E. 2011. The dual role of autophagy in cancer. Current Opinion in Pharmacology, 11:294–300.

The main function of the tumor suppressor Retinoblastoma (RB) is the regulation of the G1/S phase transition. This event is critical for the proliferation of normal cells in tissues, and its inhibition is one of the most important hallmarks leading to cancer. In resting cells RB is unphosphorylated and represses E2F-mediated gene expression. Upon entry into cell cycle, Rb becomes phosphorylated at the C-term through the action of Cyclin-Cdk complexes thus leading to its inactivation and the transcription of essential genes for S phase entry. Upon stress, cells deploy different mechanisms in order to adapt and increase their chances of survival. Among these, the control of cell division is essential. It is well established that stress-activated protein kinases (SAPKs) such as p38 play a key role in cell cycle regulation. During the G1-S transition, p38 regulates essential components of the cell cycle machinery such as the cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitors p21Cip1, p27Kip1and p57Kip2. The CDK inhibitor p57Kip2 is phosphorylated by p38 which enhances its association to CDK2-Cyclin complexes and leads to reduced CDK2 activity. As a consequence, cells transiently arrest at the G1 cell phase [1]. However, stressed p57Kip2 knockout cells are still able, albeit to a lesser extent, to delay G1, which is an indication that other mechanisms involved in cell cycle control exist. Remarkably, upon stress, p38 also inhibits the transcription of E2F-dependent genes, which are necessary for cell cycle progression. These results prompted us to question whether p38 might be controlling Rb activity. Our results show that, upon stress p38 phosphorylates the N-term of Retinoblastoma (RB), making RB insensitive to cyclin-dependent kinase (CDK)-Cyclin inactivation and increases its affinity toward the E2F transcription factor, thus repressing E2F-mediated gene expression and delaying cell-cycle progression [2,3].This novel mechanism of RB regulation represents an opportunity for developing new cancer drug treatments for tumors by developing compounds capable of promoting the association of E2F transcription factors to the N-term of RB.

1. Joaquin M, Gubern A, Posas F. A novel G1 checkpoint mediated by the p57 CDK inhibitor and p38 SAPK promotes cell survival upon stress. Cell Cycle 2012b; 11:3339-40.
2. Gubern A, Joaquin M, Marquès M, Maseres P, Garcia-Garcia J, Amat R, González-Nuñez D, Oliva B, Real FX, de Nadal E, Posas F. The N-Terminal Phosphorylation of RB by p38 Bypasses Its Inactivation by CDKs and Prevents Proliferation in Cancer Cells. Mol Cell. 2016 Oct 6;64(1):25-36.
3. Joaquin M, de Nadal E, Posas F. An RB insensitive to CDK regulation. Mol Cell Oncol. 2016 Dec 14;4(1):e1268242.

In tumors, the recruitment of immune cells with suppressive capacity and the main characteristics of the tumor microenvironment (increased levels of adenosine, low oxygen and acidic pH) favor that T cells become anergic and the activation of the TCR does not occur or occurs in a deficient manner. Targeting and manipulation of the immune system constitutes thus a major priority in the treatment of cancer. The Diacylglycerol kinases (DGK) are a family of enzymes that phosphorylate diacylglycerol (DAG) transforming this lipid into phosphatidic acid (PA). In T lymphocytes DGK act as negative regulators of the immune response metabolizing the DAG generated upon T cell receptor (TCR) triggering. This lipid second messenger facilitates the activation of the Ras/ERK (extracellular signal-regulated kinase) cascade, providing a direct input for AP-1 (activator protein-1)-mediated transcription and the expression of activation markers such as CD69 or CD25. The over-activation and/or expression of specific DGK isoforms drive T lymphocytes into a hypofunctional or anergic state. Tumor infiltrating lymphocytes (TILs) show elevated expression of certain DGK isoforms. In addition, tumors express high levels of DGK, suggesting the contribution of this enzyme family to the mechanism that regulate tumor immune evasion. Targeting DGK activity could contribute to block tumor growth and enhance T cell immunity. The generation and validation of different tools to monitor the effectiveness of known and potential new DGK inhibitors is needed. Here we design and optimize robust and reproducible cell-based trials for screening processes as well as to develop reliable sensors for DGK activity. We used different strategies to validate the effects of the previously reported DGK inhibitor R59949 and test the effect over DGK activity of a structurally similar molecule previously characterized as an anti-anxiety, antidepressive and antipsychotic agent. In addition, we pursue to better understand the different DGK functions in tumors and immune system, focusing on the possible additional effects of DGK inhibitors and the mechanisms that modulate DGK expression and activity.